一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
本方案針對(duì)大批量油田來(lái)源分離菌株進(jìn)行培養(yǎng)，利用芬蘭Kibron?Delta?8高通量表面張力檢測(cè)儀完成快速初篩，依靠發(fā)酵上清油水界面張力、氣?液表面張力數(shù)值，初步篩選能夠分泌生物表面活性劑、具備原油降解潛力的功能菌株。
原油屬于疏水有機(jī)物質(zhì)，微生物分泌的糖脂、脂肽類(lèi)胞外活性劑可以降低油水界面張力，乳化分散原油，為菌體接觸、降解石油烴創(chuàng)造條件。界面張力越低代表菌株代謝產(chǎn)物乳化原油的能力越強(qiáng)；該初篩方式無(wú)需復(fù)雜的原油降解定量檢測(cè)，可以一次性處理上百份菌株樣品，縮減大規(guī)模菌種篩選的工作量。
二、實(shí)驗(yàn)前期準(zhǔn)備
1.儀器與耗材準(zhǔn)備
核心儀器選用芬蘭Kibron Delta?8高通量表面張力分析儀，負(fù)責(zé)大批量菌株樣品快速篩查；搭配Epsilon動(dòng)態(tài)界面張力儀用于初篩優(yōu)勢(shì)菌株做動(dòng)態(tài)吸附曲線復(fù)核；配置Wilhelmy合金探針、帕爾貼恒溫樣品基座、石英微量樣品杯、384孔低吸附微孔板、探針火焰灼燒清潔組件、儀器配套采集軟件。
輔助設(shè)備包含超凈工作臺(tái)、恒溫振蕩搖床、高速冷凍離心機(jī)、pH計(jì)、0.22 μm低吸附水系濾膜、超聲清洗儀、無(wú)菌離心管、一次性無(wú)菌取樣管。
實(shí)驗(yàn)耗材為油田污泥、油水樣本分離得到的全部待測(cè)菌株、以原油為唯一碳源的篩選培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液、酸堿調(diào)節(jié)劑、18.2 MΩ超純水、無(wú)水乙醇、異丙醇、油田現(xiàn)場(chǎng)原油。
儀器預(yù)處理規(guī)范
整機(jī)通電預(yù)熱30 min，檢測(cè)溫度設(shè)置30 ℃，和降解菌株搖瓶培養(yǎng)溫度保持恒定。
合金探針每一次樣品檢測(cè)之前使用丁烷火焰灼燒，清除探針表面粘附的脂類(lèi)、胞外多糖殘留物，冷卻之后執(zhí)行零點(diǎn)校準(zhǔn)；純水的平衡表面張力穩(wěn)定處于71.8~72.2 mN/m，基線連續(xù)30 min波動(dòng)小于0.2 mN/m之后再開(kāi)啟檢測(cè)工作。
微量樣品杯、384孔微孔板依次異丙醇擦拭、無(wú)水乙醇沖洗、超純水多次潤(rùn)洗之后氮?dú)獯蹈桑徊僮髌陂g手部禁止觸碰容器內(nèi)壁，防止油脂污染氣?液、油水界面。儀器放置減震臺(tái)面，關(guān)閉防風(fēng)防護(hù)罩，減少樣品水分蒸發(fā)和揮發(fā)。
2.菌株培育、實(shí)驗(yàn)組搭建以及發(fā)酵上清預(yù)處理
大規(guī)模菌株活化和搖瓶培養(yǎng)
所有從油田環(huán)境分離獲得的候選菌株，在固體平板完成傳代活化；之后轉(zhuǎn)接至原油唯一碳源液體培養(yǎng)基。每一株菌種設(shè)置三組生物學(xué)平行搖瓶；空白對(duì)照組設(shè)置未接入菌株的原油無(wú)菌培養(yǎng)液，放置在相同搖床環(huán)境同步培養(yǎng)。
全部搖瓶統(tǒng)一培養(yǎng)轉(zhuǎn)速、溫度、發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)，保證所有菌株培養(yǎng)條件一致，消除培養(yǎng)環(huán)境帶來(lái)的實(shí)驗(yàn)誤差。
發(fā)酵上清預(yù)處理
1.培養(yǎng)結(jié)束之后取出菌液，8000 r/min常溫離心15 min，沉降菌體、原油懸浮顆粒和固體雜質(zhì)，緩慢吸取上層澄清發(fā)酵上清；
2.上清當(dāng)中殘留細(xì)小油滴和菌體碎屑的時(shí)候選用低吸附水系濾膜緩慢過(guò)濾；液體清澈透亮直接跳過(guò)過(guò)濾工序，避免疏水生物表面活性劑被濾膜吸附損耗；
3.待測(cè)上清放置至30 ℃恒溫之后低速超聲脫氣6?8 min，調(diào)低超聲功率，防止高溫造成表面活性物質(zhì)分解；
4.樣品現(xiàn)處理現(xiàn)測(cè)，短期存放條件為4 ℃冷藏，存放時(shí)長(zhǎng)不能超過(guò)8 h；
5.顛倒離心管的時(shí)候動(dòng)作輕柔，禁止劇烈搖晃產(chǎn)生大量氣泡以及乳化油滴。
3.預(yù)實(shí)驗(yàn)基線驗(yàn)證
取空白原油培養(yǎng)基上機(jī)開(kāi)展90 min氣?液以及油水界面張力測(cè)試，確認(rèn)空白培養(yǎng)液本身不會(huì)大幅度降低油水界面張力。
選取2至3株待測(cè)菌株上清開(kāi)展預(yù)測(cè)試，確認(rèn)探針潤(rùn)濕正常，儀器可以檢出胞外活性劑引發(fā)的界面張力下降。
三、標(biāo)準(zhǔn)化上機(jī)檢測(cè)完整操作流程
1.Delta?8高通量大批量菌株初篩流程
1.按照菌株編號(hào)順序?qū)⑺写郎y(cè)發(fā)酵上清添加進(jìn)384孔低吸附微孔板，單孔添加50 μL待測(cè)上清；
2.微孔板加蓋之后恒溫靜置平衡25 min，減少水分揮發(fā)；
3.將微孔板安置在恒溫載板，啟動(dòng)儀器自動(dòng)序列檢測(cè)程序；優(yōu)先測(cè)定油水界面張力，每一個(gè)微孔重復(fù)檢測(cè)三次，取平均值作為該菌株上清界面張力結(jié)果；
4.整塊微孔板檢測(cè)結(jié)束之后開(kāi)啟探針陣列高溫灼燒清潔；每隔二十個(gè)樣品孔放置空白培養(yǎng)基對(duì)照孔，用來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)控基線漂移情況。
2.Epsilon儀器對(duì)候選優(yōu)勢(shì)菌株精細(xì)復(fù)核
高通量篩查結(jié)束之后，挑選界面張力較低的潛力菌株，使用單通道Epsilon動(dòng)態(tài)界面張力儀測(cè)定完整的張力?時(shí)間吸附動(dòng)力學(xué)曲線。
吸取150 μL脫氣后的發(fā)酵上清沿著石英樣品杯內(nèi)壁緩慢加注，液面不可出現(xiàn)氣泡。樣品杯安放于帕爾貼恒溫基座，關(guān)閉防風(fēng)罩靜置10 min。
開(kāi)啟采集程序，采集時(shí)長(zhǎng)設(shè)置90 min，保存動(dòng)態(tài)吸附曲線，讀取平衡油水界面張力數(shù)值。
單份樣品檢測(cè)結(jié)束之后火焰灼燒探針清除油污和黏性代謝殘留物，廢液倒掉、容器清洗晾干之后繼續(xù)下一組樣品檢測(cè)。
3.平行樣品質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
同一菌株三份平行上清測(cè)得的油水平衡界面張力差值大于0.5 mN/m，樣品需要重新離心、脫氣之后復(fù)測(cè)。全部待測(cè)菌株樣品檢測(cè)溫度、靜置時(shí)長(zhǎng)、探針下落參數(shù)保持統(tǒng)一，保障多組菌株的數(shù)據(jù)具備橫向?qū)Ρ葪l件。
4.實(shí)驗(yàn)收尾和儀器養(yǎng)護(hù)
大規(guī)模菌株篩查工作結(jié)束之后反復(fù)灼燒探針，清理頑固油相附著物、胞外聚合物殘留；微孔板、樣品杯使用有機(jī)溶劑浸泡除油之后純水沖洗晾干。導(dǎo)出每一株菌株對(duì)應(yīng)的油水界面張力和氣液表面張力數(shù)據(jù)，綁定對(duì)應(yīng)的菌株編號(hào)；探針?lè)胖酶稍锓缐m環(huán)境存放。
四、數(shù)據(jù)處理、原油降解潛力菌株篩選標(biāo)準(zhǔn)
1.關(guān)鍵界面參數(shù)提取
提取界面吸附誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)、張力下降速率、氣?液平衡表面張力、油水界面張力，整理成菌株?界面張力數(shù)據(jù)表。油水界面張力數(shù)值越低，菌株分泌出的生物表面活性劑乳化原油的性能越強(qiáng)。
2.菌株分級(jí)初篩
按照油水界面張力數(shù)值劃分等級(jí)，篩選出界面張力最低的一批菌株當(dāng)作優(yōu)勢(shì)候選菌種；油水界面張力和空白對(duì)照組接近的菌株判定為低活性菌株直接篩除。
對(duì)比張力下降速率，下降速度越快代表胞外兩親物質(zhì)可以快速鋪展至油水界面，乳化響應(yīng)速度優(yōu)異。
3.后續(xù)深度試驗(yàn)規(guī)劃
經(jīng)過(guò)Kibron張力初篩得到的優(yōu)勢(shì)菌株，接下來(lái)開(kāi)展原油烴降解率測(cè)定、耐鹽耐溫測(cè)試、發(fā)酵條件優(yōu)化等進(jìn)階試驗(yàn)。
五、關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)控制要點(diǎn)
1.油田菌株發(fā)酵上清含有原油油滴、黏性胞外聚合物，油污極易粘附金屬探針，每一次檢測(cè)結(jié)束都需要灼燒清潔探針；樣品檢測(cè)順序依照編號(hào)依次篩查，規(guī)避高活性代謝物、油污殘留污染低活性菌株樣品。
2.全程恒定檢測(cè)溫度，溫度浮動(dòng)會(huì)改變生物表面活性劑膠束結(jié)構(gòu)、原油黏度，干擾油水界面張力對(duì)比結(jié)果。
3.所有候選菌株的培養(yǎng)基、碳源、培養(yǎng)周期、搖床轉(zhuǎn)速必須統(tǒng)一，培養(yǎng)條件不一致時(shí)，篩查結(jié)果不具備可比性。
4.禁止劇烈震蕩發(fā)酵上清，人為產(chǎn)生的氣泡會(huì)消耗溶液當(dāng)中兩親活性分子，造成動(dòng)態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線失真。
5.上清液體清澈透亮?xí)r跳過(guò)濾膜過(guò)濾步驟，脂肽、糖脂類(lèi)疏水活性劑極易被普通濾膜吸附，造成測(cè)得界面張力偏高，錯(cuò)過(guò)高產(chǎn)活性物質(zhì)菌株。
6.檢測(cè)油水界面張力時(shí)原油取用油田原位原油，不要使用替代油品，保證篩選條件貼合油田實(shí)際環(huán)境。
