一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
1. 建立Kibron儀器測(cè)試可降解塑料降解液界面張力的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，獲取動(dòng)態(tài)表面張力、平衡表面張力、張力下降速率等參數(shù)。
2. 追蹤不同降解時(shí)間點(diǎn)降解液的界面張力變化，建立張力參數(shù)與塑料降解程度的對(duì)應(yīng)關(guān)系。
3. 通過多級(jí)空白扣除，消除降解介質(zhì)、微生物代謝基質(zhì)帶來的本底干擾，區(qū)分介質(zhì)效應(yīng)與塑料降解產(chǎn)物帶來的真實(shí)界面響應(yīng)。
4. 將界面張力變化與分子量、失重率、CO?釋放量等常規(guī)降解指標(biāo)聯(lián)合比對(duì)，為可降解塑料降解評(píng)價(jià)增加一種快速理化輔助表征手段。
二、儀器材料與試劑準(zhǔn)備
1. 儀器
芬蘭Kibron表面張力儀，可選EZ?Pi Plus單通道或者Delta?8高通量機(jī)型，DyneProbe鉑銥探針，溫控樣品臺(tái)，配套Kibron分析軟件。塑料降解培養(yǎng)裝置，高速冷凍離心機(jī)，真空脫氣裝置，pH計(jì)，超純水機(jī)。單通道選用貨號(hào)3640 PTFE樣品杯，高通量使用DynePlate 96孔微孔板。配套設(shè)備用于測(cè)定塑料失重率、分子量、TOC總有機(jī)碳，作為降解程度參照指標(biāo)。
2. 試劑與樣品
可降解塑料樣品，PLA、PBAT、PBS、淀粉基可降解材料等。降解介質(zhì)，超純水、緩沖溶液、海水、堆肥浸出液等，按照模擬降解環(huán)境確定。設(shè)置三組空白，介質(zhì)空白，不加塑料的降解培養(yǎng)液；滅活塑料基質(zhì)空白，高溫滅菌塑料，和實(shí)驗(yàn)組同步降解培養(yǎng)；微生物底物空白，不含塑料只接種微生物的培養(yǎng)液。全部降解介質(zhì)提前真空脫氣10?15min。
3. 耗材
低吸附離心管，無水乙醇，0.22μm低吸附水系濾膜，低吸附移液槍頭。濾膜使用對(duì)應(yīng)降解介質(zhì)提前潤(rùn)洗，減少降解產(chǎn)生的兩親低聚物被濾膜吸附造成損失。
4. 儀器校驗(yàn)準(zhǔn)備
儀器放置防震臺(tái)面，遠(yuǎn)離空調(diào)直吹，整機(jī)通電預(yù)熱60min，關(guān)閉防風(fēng)罩。鉑銥探針依次超純水沖洗，無水乙醇沖洗，高純氮?dú)獯蹈伞z查探針尖端無彎折、無有機(jī)殘留。25℃超純水開展張力校準(zhǔn)，純水表面張力穩(wěn)定72.0?72.8mN/m，通道偏差小于0.2mN/m，基線穩(wěn)定無漂移。測(cè)試溫度固定25.0±0.5℃。
三、可降解塑料降解液樣品制備
1. 塑料降解培養(yǎng)。將塑料薄膜或顆粒置于對(duì)應(yīng)的降解體系中，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)定的溫度、轉(zhuǎn)速、通氣條件開展降解實(shí)驗(yàn)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3份生物學(xué)平行，同步準(zhǔn)備介質(zhì)空白、滅活塑料基質(zhì)空白、微生物底物空白，所有空白與實(shí)驗(yàn)組完全相同的培養(yǎng)條件。按時(shí)間梯度取樣，例如0d、7d、14d、28d、56d。
2. 樣品預(yù)處理。取出的降解混合體系，8000g冷凍離心20min，去除塑料碎片、微生物菌體、固體殘?jiān)⌒奈∩蠈咏到庖荷锨濉Ｉ锨逡菏褂妙A(yù)先潤(rùn)洗的0.22μm低吸附濾膜過濾，去除細(xì)小懸浮顆粒。操作輕柔，禁止劇烈渦旋，避免產(chǎn)生氣泡。
3. 樣品分組。分為不同時(shí)間點(diǎn)塑料降解液、介質(zhì)空白、滅活塑料基質(zhì)空白、微生物底物空白。單通道測(cè)試體積150?200μL，Delta?8高通量每孔50μL。降解產(chǎn)物穩(wěn)定性有限，樣品取樣后立即測(cè)試，不建議長(zhǎng)期儲(chǔ)存，如需短時(shí)間存放，4℃避光放置不超過12h，上機(jī)前恢復(fù)至室溫。
4. 樣品平衡。過濾完成的待測(cè)樣品與各類空白，室溫靜置平衡30min，目視檢查無沉淀、無氣泡，存在氣泡的樣品需要重新制備。同時(shí)記錄每個(gè)樣品pH，降解過程產(chǎn)生有機(jī)酸會(huì)改變pH，pH會(huì)間接影響表面張力。
四、Kibron上機(jī)完整操作流程
1. 軟件參數(shù)設(shè)置。新建動(dòng)態(tài)表面張力時(shí)間掃描程序，測(cè)試溫度25℃。降解產(chǎn)生的低聚物小分子吸附速度不一，總采集時(shí)長(zhǎng)設(shè)置90?120min，保證界面吸附達(dá)到平衡。采集間隔2?5秒每數(shù)據(jù)點(diǎn)，探針下降速度2mm/min，探針浸入液面深度0.3mm。每個(gè)樣品設(shè)置2次技術(shù)重復(fù)。
2. 單通道PTFE樣品杯上樣。沿杯壁緩慢加入150?200μL降解液，避免沖擊液面帶入氣泡。將樣品杯放置溫控樣品臺(tái)，關(guān)閉防風(fēng)罩靜置8?10min，消除移液擾動(dòng)。探針下降接觸氣液界面，啟動(dòng)采集，記錄完整動(dòng)態(tài)張力?時(shí)間曲線。
如果使用Delta?8高通量96孔板模式，每孔加入50μL降解液，加樣不要觸碰孔內(nèi)液面。加樣結(jié)束檢查孔內(nèi)無可見氣泡，微孔板卡緊固定，待測(cè)樣品與三類空白排布在同一塊微孔板，保證溫度環(huán)境條件一致，啟動(dòng)批量自動(dòng)測(cè)試。
3. 探針清洗流程。降解液含有低聚物、有機(jī)酸、微生物代謝物，極易吸附在鉑銥探針表面。每完成一個(gè)樣品測(cè)試，探針超純水沖洗3次，無水乙醇沖洗，高純氮?dú)獯蹈伞Ｈ繕悠窚y(cè)試結(jié)束，探針乙醇短暫浸泡，再?zèng)_洗吹干保存。
4. 測(cè)試順序。先測(cè)定超純水基線空白，確認(rèn)儀器硬件狀態(tài)正常，之后依次測(cè)定介質(zhì)空白、滅活塑料基質(zhì)空白、微生物底物空白，最后測(cè)定各組塑料降解液樣品。全部測(cè)試結(jié)束復(fù)測(cè)超純水，復(fù)測(cè)純水張力偏差大于0.2mN/m，判定探針存在吸附污染，本組數(shù)據(jù)作廢，深度清洗探針后重新開展實(shí)驗(yàn)。
五、數(shù)據(jù)處理與降解程度關(guān)聯(lián)分析
1. 導(dǎo)出全部原始動(dòng)態(tài)張力數(shù)據(jù)，對(duì)比實(shí)驗(yàn)前后兩次超純水基線，基線漂移超過0.2mN/m的數(shù)據(jù)剔除。
2. 多級(jí)空白校正，優(yōu)先選用微生物底物空白作為主要扣除空白，扣除降解介質(zhì)、微生物自身代謝產(chǎn)物帶來的本底張力，得到校正后的動(dòng)態(tài)表面張力曲線，校正后的張力下降才來源于塑料降解產(chǎn)生的兩親性低聚物片段。不可直接使用純水做空白扣除。
3. 提取校正后關(guān)鍵參數(shù)，初始表面張力，平衡表面張力，張力下降速率。計(jì)算生物學(xué)平行、技術(shù)平行的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
4. 降解程度參照指標(biāo)測(cè)定。同一批次降解體系，同步測(cè)定塑料失重率、數(shù)均分子量、TOC總有機(jī)碳、酸值等常規(guī)降解指標(biāo)。
5. 張力?降解程度關(guān)聯(lián)。隨著塑料降解進(jìn)行，大分子鏈斷裂生成兩親性低聚物，降解液平衡表面張力逐步降低。降解程度越高，釋放的兩親片段越多，平衡張力越低，張力下降速率越快。
部分體系微生物會(huì)消耗掉降解小分子，會(huì)出現(xiàn)后期張力小幅回升的現(xiàn)象，需要結(jié)合TOC、分子量綜合判斷。
界面張力僅為輔助指標(biāo)，不能單獨(dú)作為降解率判定唯一依據(jù)，需要和失重、分子量等指標(biāo)聯(lián)合使用。
六、關(guān)鍵細(xì)節(jié)與質(zhì)量控制
1. 降解液中低聚物界面吸附速度差異大，必須保證足夠采集時(shí)長(zhǎng)，使張力達(dá)到平衡，不能只讀取初期瞬間張力數(shù)值。
2. 張力測(cè)試與降解取樣必須同步進(jìn)行，樣品不可長(zhǎng)時(shí)間存放，降解產(chǎn)物會(huì)被微生物繼續(xù)消耗，造成張力數(shù)據(jù)失真。
3. 濾膜必須使用對(duì)應(yīng)降解介質(zhì)提前潤(rùn)洗，兩親低聚物容易被濾膜吸附，造成測(cè)得張力下降幅度偏小，低估降解信號(hào)。
4. 全程嚴(yán)防氣泡，降解液含有有機(jī)酸、微量有機(jī)質(zhì)，容易包裹微小氣泡，曲線出現(xiàn)無規(guī)則高頻抖動(dòng)，優(yōu)先判定氣泡干擾，需要重新制備樣品。
5. pH會(huì)顯著改變離子型降解片段的界面活性，每個(gè)樣品必須記錄pH，對(duì)比不同時(shí)間點(diǎn)結(jié)果時(shí)需要考慮pH帶來的影響。
6. 環(huán)境溫度波動(dòng)控制在±1℃以內(nèi)，臺(tái)面嚴(yán)格防震，震動(dòng)會(huì)擾動(dòng)液面，增大曲線噪音。長(zhǎng)時(shí)間測(cè)試存在溶劑揮發(fā)，測(cè)試時(shí)長(zhǎng)盡量不超過120min，環(huán)境濕度維持40%?60%，降低揮發(fā)帶來濃度漂移。
7. 空白體系必不可少，降解介質(zhì)本身、微生物代謝產(chǎn)物都可以改變表面張力，只測(cè)降解液不做空白校正，會(huì)得到錯(cuò)誤的降解判斷。
